Unidad de Biología celular: Microscopía y Citometria de flujo

Las aplicaciones de la citometría, sorter y de la microscopía confocal son muy variadas y abarcan campos tan distantes como estudios de biomedicina, estudios en alimentos o de materiales, etc. Gracias al desarrollo de nuevas sondas fluorescentes y de nuevos sistemas de detección, la diversificación en campos de estudio y nuevas aplicaciones está en continuo crecimiento. En el IIS-FJD, en el campo de la biomedicina se pueden hacer estudios tridimensionales en secciones o en montajes totales, co-localización de sondas fluorescentes, rastreo de moléculas o iones dentro de las células vivas o fijadas, medida de células, orgánulos y determinaciones de volúmenes.

Personal

• Dirección de la Unidad: Dra. Victoria del Pozo
• Responsable del Microscopía Confocal: Mª Mar González García-Parreño
• Técnico de apoyo: Zahara García de Castro

Ubicación

Funciones y objetivos

Las funciones que se realizan en la unidad son:

• Mantenimiento y calibración de los equipos del servicio.
• Gestión del control de uso de los equipos, de la contabilidad y facturación.
• Cursos de formación y supervisión en el uso de los equipos de citometría analítica.
• Mantenimiento y distribución de reactivos de uso común en citometría de flujo y sorter.
• Adquisición de muestras en FACScalibur, FACSCanto, FACSMelody.
• Análisis de los resultados obtenidos con diferentes softwares especializados.
• Asesoramiento sobre las diversas y complejas técnicas y protocolos, como los fluorocromos más adecuados para los distintos ensayos o los soportes de cultivo para los distintos tipos celulares.
• Asesoramiento en la construcción de plantillas para el citómetro de flujo y el sorter.
• Reconstrucción de las imágenes mediante el software multicolor y en 3D.
• Enlace entre los investigadores y el servicio de aplicaciones de las casas de los equipos.

Equipamiento

El IIS-FJD dispone de un citómetro, de un sorter y de un microscopio confocal Leica, siendo en la actualidad las infraestructuras de carácter institucional más importantes y utilizadas que posee.

Citómetros: En la unidad funciona un citómetro digital de dos láseres y cuatro detectores de fluorescencia (FACSCanto II), de Becton Dickinson. Es un sistema de análisis multicolor con capacidad de adquisición y tratamiento de datos digital, diseñado para aplicaciones clínicas y de investigación. El equipo dispone de un software de adquisición y análisis nuevo, así como de un módulo que permite incorporar sistemas de adquisición automática de muestra a partir de tubos o placas, lo que ahorra mucho tiempo al investigador.

Utilidades comunes de la citometría de flujo:

• Inmunofenotipo.
• Análisis del ciclo celular.
• Genes reporteros.
• Medida de la proliferación celular.
• Apoptosis.
• Flujo de calcio.
• Señalización intracelular: detección de fosfoproteínas a nivel unicelular.
• Ensayos multiplexado de moléculas en disolución.

Sorters: En la unidad actual funciona un clasificador de células (sorter) que contiene tres láseres (azul, rojo y violeta) y ocho detectores de fluorescencia (FACSMelody), de Becton Dickinson. Se encarga de la separación física de partículas en base a la expresión diferencial de uno o varios parámetros analizables por técnicas de citometría de flujo analítica. Dispone de un software de adquisición y de análisis nuevo que permite la adquisición automática de muestras tanto en tubo como en placa.

Utilidades comunes del sorter:

• Separación de poblaciones celulares.
• Separación de células vivas para cultivo celular.
• Separación de células fijadas para un posterior análisis genético.
• Clonajes.

Confocales: La microscopía confocal se encuentra englobada dentro de la microscopía óptica, concretamente de la microscopía de fluorescencia. El desarrollo de nuevas sondas fluorescentes y el aumento de resolución que proporciona la utilización de la microscopía confocal han hecho posible que la fluorescencia sea una de las técnicas más utilizadas en la actualidad. La combinación de la captación de imágenes en el plano focal con el software permite la utilización del microscopio confocal como un microtomo óptico, lo cual posibilita la obtención de secciones ópticas de la muestra, base para la obtención de imágenes en tres dimensiones.

De los dos confocales disponibles, el de mayor utilización por ser más actual es el microscopio confocal TCS SP5 de Leica que cubre la mayoría de los requerimientos en microscopía confocal con unos resultados óptimos y proporciona un rango completo de velocidades de escáner a la más alta resolución. Este equipo está configurado con detectores SP (cinco canales simultáneamente), un escáner en tándem (convencional y resonante para adquisición de imágenes a alta velocidad), y sistema AOBS para separación dinámica de luz. El sistema TCS SP5 produce imágenes brillantes y sin ruido causando el mínimo daño a la muestra. Este microscopio confocal cuenta con las siguientes líneas láser de excitación: 405 nm, 458 nm, 476 nm, 488 nm, 496 nm, 514 nm, 561nm, 594 nm y 633 nm.

El microscopio es un modelo DMI6000 invertido de Leica, automático, con pletina motorizada, incubadora de temperatura y suministro de CO2, para mantener las células vivas a una atmósfera determinada. Como fuentes de iluminación dispone de una fuente EL6000 (Leica) para la visualización de las muestras con fluorescencia; y luz transmitida para campo brillante y contraste diferencial de interferencia (DIC).

Para visualizar la muestra, este sistema está equipado con los siguientes filtros:

• A (excitación UV BP 340-380; emisión LP 425) para Alexa 405 o DAPI, etc.
• I3 (excitación azul BP 450-490; emisión LP 515) para FITC, Cy2, etc.
• N2.1 (excitación verde BP 515-560; emisión LP 590) para TRITC, Cy3, etc.
• L5 (excitación 480/40; emisión 527/30), más restrictivo que el filtro I3.

Los objetivos disponibles en este equipo son:

• HC PL APO CS 10X/0.4 DRY.
• HCX PL APO 20X/0.7 IMM (para agua o aceite).
• HCX PL APO CS 40X/1.25 OIL.
• HCX PL APO lambda blue 63X/ 1.4 OIL (con corrección cromática especial en el rango del azul).
• HCX PL APO CS 100X/1.4 OIL.
• HCX PL APO CS 63X/1.3 GLYC 21 ºC (distancia de trabajo de 280 μm para muestras gruesas y temperatura 21 ºC).

Utilidades:

• Colecciones de secuencias seriadas.
• Reconstrucciones tridimensionales del objeto estudiado: piel, etc.
• Medidas de co-localización de marcadores.
• Imágenes laterales del objeto.
• Endocitosis.
• Superposición de imágenes obtenidas por diferentes técnicas.
• Microscopía time-lapse. La observación de células vivas con microscopía de fluorescencia confocal permite el seguimiento intracelular de moléculas fluorescentes.

Normas de acceso y seguridad

La utilización de los servicios, tanto de citometría de flujo como de microscopía confocal, se hará mediante la correspondiente solicitud de sesiones al responsable del mismo.

Dichas sesiones se establecerán dentro de los horarios en los que la Unidad esté activa y en función de las disponibilidades de equipos existentes. En caso de necesitarse más horas de las concertadas se solicitará una nueva asignación.

Se respetarán los horarios de reserva, teniendo en cuenta los tiempos de lavado (en el caso del área de citometría de flujo), así como las normas básicas de encendido y apagado del aparataje.

Se cumplirán las normas y guías establecidas sobre bioseguridad dentro del hospital.